液相色譜
色譜分析法是分析化學(xué)中最強(qiáng)大的工具之一，也是實(shí)驗(yàn)室中最常見的方法之一。 在這項(xiàng)技術(shù)中，流動(dòng)相是液體。
高效液相色譜法 (HPLC)
高壓液相色譜法（現(xiàn)被稱為高效液相色譜法，HPLC）是一項(xiàng)色譜技術(shù)，用于識(shí)別、量化、分離和純化混合物中存在的單個(gè)化合物[1]。
高效液相色譜法的工作原理是什么？
采用高效液相色譜法 (HPLC) 時(shí)，讓樣品混合物與液體溶劑在高壓下一起通過填充有固體吸附材料的純化柱。 借助泵，累積系統(tǒng)內(nèi)的壓力。 工作原理是，混合物中的每種化合物與純化柱中的吸附材料相互作用略有不同，從而導(dǎo)致不同成分具有不同流速。 這導(dǎo)致各成分從純化柱流出時(shí)會(huì)分離。 所使用的吸附材料通常為顆粒狀，由構(gòu)成“固定相”的固體粒子（諸如二氧化硅）組成。 加壓液體是溶劑混合物，如水和有機(jī)液體（如甲醇和乙腈），此類液體構(gòu)成“流動(dòng)相”。
檢測器連接至數(shù)字微處理器和用于數(shù)據(jù)采集和分析的用戶軟件。 分離的化合物可視化為“峰”，峰的數(shù)量與混合物中分離的成分的數(shù)量相對(duì)應(yīng)。 峰面積與混合物中的化合物濃度成正比[2]。 色譜技術(shù)的兩個(gè)峰之間的分辨率是實(shí)驗(yàn)期間物質(zhì)分離的程度。 高分辨率表示化合物分離良好。
高效液相色譜法有何用途？
高效液相色譜法在生物化學(xué)、分析化學(xué)、藥品、法醫(yī)學(xué)、食品研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。 例如， 運(yùn)動(dòng)員禁用物質(zhì)的檢測中也會(huì)用到 HPLC。
您為什么要使用高效液相色譜？
HPLC 既經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，又具備適用能力。 它擁有數(shù)據(jù)管理和儀器驗(yàn)證等實(shí)用優(yōu)勢。
超高效液相色譜 (UHPLC)
超高效液相色譜 (UHPLC) 是 HPLC 的一種變體，它使用較小的粒子來提高色譜性能，并且需要較高的壓力。 與 HPLC 類似，水污染物可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。然而，由于 UHPLC 的靈敏度較高，結(jié)果可能會(huì)更為極端。
HPLC 和 UHPLC 均可用于液相色譜分析法，但兩者運(yùn)行所需的設(shè)備并不相同，各有不同的優(yōu)勢。 較短的柱長意味著超高效液相色譜法比傳統(tǒng) HPLC 的分辨率更佳。
離子色譜法
離子色譜法可基于離子和極性分子與離子交換介質(zhì)柱的相互作用來分離。 該方法幾乎可用于任何一種帶電分子，包括大蛋白、小核苷酸和氨基酸。 它被廣泛用于測定無機(jī)和有機(jī)陽離子和陰離子。
試劑水的水質(zhì)幾乎可以影響 HPLC 分析的各個(gè)方面，從樣品和標(biāo)準(zhǔn)制備到柱沖洗和洗脫均有影響。 這也使水成為 HPLC 過程中消耗量最大的試劑。
通常將 2 級(jí)純水用于空白制備、標(biāo)準(zhǔn)液、洗脫劑和樣品預(yù)處理；然而，由于梯度 HPLC 的檢測限值極低，用水要求更為嚴(yán)格，需要最高的水質(zhì)。
很大一部分 HPLC 性能問題由 HPLC 洗脫液、標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的制備過程中所用水的水質(zhì)較差而導(dǎo)致。 水質(zhì)差或受污染的水通過在色譜分離期間引入鬼峰、改變固定相選擇性、影響基線來影響分辨率。
此外，它還可導(dǎo)致污染物在固定相中積聚，從而導(dǎo)致柱體堵塞。 這會(huì)導(dǎo)致壓力增加，樣品運(yùn)行時(shí)間發(fā)生變化。 數(shù)據(jù)質(zhì)量欠佳，例如保留時(shí)間變化、分辨能力降低或出現(xiàn)鬼峰，可能表明有機(jī)物、離子、細(xì)菌或粒子物已造成了污染。
水中影響 HPLC 結(jié)果的各類污染物是什么 ？
1. 有機(jī)物
超純水中的有機(jī)污染物可以以不同方式影響色譜分離：
(i) 縮短純化柱壽命 - 吸附在柱表面的有機(jī)分子可以減緩樣品和溶劑分子進(jìn)入純化柱多孔珠內(nèi)的吸附點(diǎn)（固定相）。 這會(huì)造成純化柱分離化合物的能力降低或者分辨能力降低，縮短純化柱壽命。
(ii) 降低靈敏度 - 洗脫水中的有機(jī)分子會(huì)與樣品分子競爭吸附到純化柱多孔珠上（固定相）。 這樣會(huì)減少吸附于純化柱上的樣品分子數(shù)量，結(jié)果導(dǎo)致洗脫過程中所釋放的分子數(shù)量減少。
(iii) 數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確 - 有機(jī)物可在純化柱頂部積聚，之后以洗脫液形式聚集，此類有機(jī)物可能會(huì)產(chǎn)生污染物或鬼峰。
(iv) 保留時(shí)間變化 - 高濃度有機(jī)物可在純化柱中形成新固定相，可導(dǎo)致保留時(shí)間變化和拖尾峰出現(xiàn)。 也可導(dǎo)致回壓增加。
因此，準(zhǔn)確監(jiān)測用于 HPLC 應(yīng)用的水的有機(jī)物濃度很關(guān)鍵。 總有機(jī)碳量 (TOC) 是衡量水中總有機(jī)物量的指標(biāo)。 TOC 以百萬分之一（ppm）或十億分之一（ppb) 計(jì)。 以高 ppb 存在的有機(jī)物可改變混合物中微量成分的光譜識(shí)別并影響峰定量。
HPLC 系統(tǒng)可能受到各種 TOC 污染源的影響。 包括水、純化介質(zhì)中的滲出物、管道、容器、細(xì)菌污染物以及潛在的空氣吸入。 事實(shí)上，現(xiàn)在建議避免使用未經(jīng)新鮮純化的高純度瓶裝水。 這是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室環(huán)境下放置超過 8 小時(shí)（接觸大氣有機(jī)物）的 HPLC 瓶裝水或蒸餾水容易受到 TOC 水平上升的影響。
Fig 1: Comparison of the TOC levels in HPLC-grade water and Ultrapure water.
圖 1 比較了在 254 納米和 214 納米波長下測量的 HPLC 級(jí)水和超純水的色譜輸出。 相較于超純水[2]，HPLC 級(jí)水的 TOC 水平更高，該水從純化柱洗脫出來，可導(dǎo)致基線變化，峰大小和數(shù)量增加。
因此，使用純水進(jìn)行 HPLC 分析至關(guān)重要，并且保持水不含各種污染物也非常重要。 色譜儀除了確保有機(jī)溶劑、標(biāo)準(zhǔn)液和其他 HPLC 流動(dòng)相成分的純度外，還必須確保試劑水水質(zhì)良好，沒有任何污染物。
2. 粒子和膠質(zhì)
若水樣本中存在粒子和膠質(zhì)，除了物理上堵塞柱子外，還會(huì)對(duì)泵和注射器造成損害。 這些也可以在結(jié)合有樣品成分的純化柱內(nèi)作為固相。 膠質(zhì)還可以不可逆地吸附至純化柱材料上，以此防止樣品成分與純化柱結(jié)合。
3. 離子
溶劑中有離子存在也可影響色譜分離。 任何紫外線吸收的離子，例如硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫酸鹽、溴化物、氯化物和氟化物，都可以穿過純化柱并在色譜圖中形成峰，從而使數(shù)據(jù)難以分析。
在影響 HPLC 分析的不同水污染物中，目前為止，有機(jī)物是水純度的最重要決定因素。 實(shí)驗(yàn)證據(jù)充分表明，新鮮制備的超純水應(yīng)該是 HPLC 的適用之選，因?yàn)槠渌?，即蒸餾水或甚至 HPLC 級(jí)瓶裝水仍然含有相對(duì)較多的有機(jī)物，這可能會(huì)損害色譜圖的質(zhì)量和儀器的性能（見圖1 ）。
因此，必須確保使用高標(biāo)準(zhǔn)水純化系統(tǒng)，并妥善維護(hù)系統(tǒng)本身。
水測量
確保您針對(duì)特定應(yīng)用使用了恰當(dāng)類型的水。 液相色譜法應(yīng)用的相關(guān)要求如下：
| 所需靈敏度 | 電阻率 ( MΩ .cm)* | 總有機(jī)碳量 (ppb) | 過濾器 (微米) | 細(xì)菌 (CFU/ml) | 內(nèi)毒素 (EU/ml) | 核酸酶 | 水的級(jí)別 |
| 離子色譜法 | 一般高 | > 5 18.2 | < 50 < 10 | < 0.2 < 0.2 | < 10 < 1 | NA NA | NA NA | 一般 實(shí)驗(yàn)室 超純 |
| HPLC | 一般高 | >1 > 18 | < 50 < 3 | < 0.2 < 0.2 | < 1 < 1 | NA NA | NA NA | 一般 實(shí)驗(yàn)室 超純 |
ELGA Veolia 如何解決 HPLC 的水純度問題？
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總結(jié)
水作為實(shí)驗(yàn)室試劑，其純度是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。 高度敏感的技術(shù)，如 HPLC 需要純度非常高的水，這意味著所使用的水應(yīng)具有最低的 TOC 水平，并且不含任何其他污染物。 新鮮制備的超純水是 HPLC 實(shí)驗(yàn)的適用之選， ELGA 各系列水純化系統(tǒng)有助于全球研究人員確保其實(shí)驗(yàn)中使用的水具有所需的純度。
參考資料：
[1] Jena A Kumar. HPLC: Highly Accessible Instrument in Pharmaceutical Industry for Effective Method Development. Pharm Anal Acta 2012;3. doi:10.4172/2153-2435.1000147.
[2] Malviya R, Bansal V, Prakash Pal O, Kumar Sharma P. High performance liquid chromatography: A short review. J Glob Pharma Technol 2010;2:22–6.
