什么是HPLC？

高效液相色譜法（HPLC）可用于分離化合物的成分，告訴您混合物中每種化合物的含量，并幫助確定每種化合物是什么。
HPLC 是分析各種有機化合物的首選技術(shù)。揮發(fā)性化合物（VOC 和 SVOC）通常最好用氣相色譜儀（GC） 或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進行分析，但高效液相色譜法（HPLC）適用于更多種類的混合物，包括非揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定分子。它的優(yōu)點包括多功能性、靈敏度和適用于非常復(fù)雜的混合物。

HPLC是如何工作的?

使用高效液相色譜法進行分離是基于分析物中不同化合物與流動相（洗脫液）和固定相的親和力。樣品中某種成分的分子與填料之間的特殊分子間相互作用實際上會導(dǎo)致這些分子被固定相吸收。

與流動相相比，與固定相的相互作用越大，與固定相相互作用的時間就越長，在色譜柱上停留的時間也就越長，該成分的保留時間（Rf）也就越長。該技術(shù)的強大之處在于可使用多種流動相和固定相來微調(diào)分離效果。

HPLC有哪些不同用途?

高效液相色譜是一種常用且功能強大的色譜技術(shù)，可應(yīng)用于制藥、生物分析、食品和飲料、臨床、法醫(yī)、環(huán)境和藥物開發(fā)實驗室等領(lǐng)域。
例如，在醫(yī)療環(huán)境中，高效液相色譜可用于確定生物材料中的物質(zhì)含量和濃度。這可能包括尿液中的藥物分析或血清中維生素含量的檢測。

HPLC有哪些不同類型?

正相高效液相色譜法
在正相色譜中，固定相為非極性，流動相為極性。這意味著樣品中的任何非極性物質(zhì)都能更快地洗脫出來，因為它們與流動相更接近，移動速度更快。

反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法與正相色譜法相反。也就是說，極性流動相（如水和極性有機溶劑）與非極性疏水固定相配合使用。
與正相高效液相色譜法相比，反相高效液相色譜法通常更受青睞，因為使用水作為溶劑可消除分析物的保留時間因大氣吸水而發(fā)生偏差的危險。反相高效液相色譜法也被認為更加靈活，因為疏水固定相可以與疏水、親水、離子和可電離化合物結(jié)合使用，分離出不同的化合物。

等度洗脫與梯度洗脫

等度洗脫是指在流動相中保持恒定的梯度，而梯度洗脫是指在實驗中流動相的濃度發(fā)生變化。
與等度洗脫相比，梯度洗脫有多個優(yōu)點，因為它能使整個色譜圖中寬度相似的色譜峰間距更加均勻。在等度洗脫過程中，色譜峰的分辨率通常會降低，在洗脫過程的開始階段，色譜峰之間的距離會非常近，而在洗脫過程的最后階段，色譜峰之間的距離會變得更寬。梯度洗脫還能縮短運行時間。
不過，等度洗脫通常比梯度洗脫更受青睞，因為梯度洗脫過程需要操作人員更加細心和規(guī)范。等度洗脫所需的專業(yè)色譜設(shè)備也較少。

純水對高效液相色譜有何影響?

高效液相色譜非常依賴于水的純度。使用不純的水源制備洗脫液、空白樣、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品可能會在實驗中引入污染，影響分辨率、整合度和基線，從而降低色譜性能。由于水是 HPLC 中用量最大的試劑，因此所選水的純度必須符合應(yīng)用靈敏度的要求。

你應(yīng)該使用哪種類型的水?

對于應(yīng)用靈敏度一般的 HPLC 實驗，我們建議使用 II⁺ 型水。如果應(yīng)用的靈敏度較高，則應(yīng)使用 I⁺ 超純水，因為它的電阻率大于 18 MΩ.cm，TOC 值小于 2ppb，細菌小于 1 CFU/mL，內(nèi)毒素小于 0.03。

儀器儀表

泵:
如果 HPLC 是梯度系統(tǒng)，則可采用低壓梯度 (LPG) 或高壓梯度 (HPG) 流程。在 HPG 中，溶劑在排出側(cè)混合，并從單個泵輸入。而在 LPG 中，溶劑在吸入側(cè)混合。

色譜柱:
色譜柱是所有 HPLC 系統(tǒng)的核心，因為它負責(zé)分離樣品化合物。根據(jù)實驗需要，有多種不同的 HPLC 柱可供選擇。例如，色譜柱可填充各種不同的填料，以支持各種類型的 HPLC，如反相或正相。

檢測器:
檢測器測量從色譜柱洗脫的每種物質(zhì)的時間和數(shù)量。檢測器記錄整個過程中的成分差異，并將其轉(zhuǎn)化為電信號，從而繪制色譜圖。

色譜參數(shù)：

在整個色譜過程中，檢測器產(chǎn)生的電子信號可通過配套的計算機轉(zhuǎn)化為色譜圖。這些圖表可用于確定樣品中存在的物質(zhì)及其數(shù)量。每個信號峰都代表了流動相通過色譜柱的分析物。
從這些峰值中可以獲得各種定性信息，從峰值出現(xiàn)的時間到物質(zhì)的濃度（以圖表下的面積表示）。
同樣重要的是要考慮過程的分辨率。兩個峰之間的分辨率值達到或超過 1.5 意味著樣品成分的分離程度達到了可以準(zhǔn)確測量峰的高度和寬度的程度。分辨率可通過基本分辨率方程計算得出。
該方程中考慮的 HPLC 參數(shù)包括效率因子 (N)、保留因子 (kappa prime) 和分離因子 (α)。然后可以進行調(diào)整，如改變實驗中使用的溶劑或改變溫度，以改變這些參數(shù)并提高實驗的分辨率。

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